第一章转基因是什么？

本章是对转基因技术和基因工程技术做的一个概述。主要介绍转基因和基因工程的概念，转基因与非转基因的区别，转基因育种与杂交育种的关系，基因工程技术诞生和发展的简短历史以及基因工程操作的基本流程。

●1.1关于转基因？你知多少

转基因变成大家很熟悉的一个名词了。本节主要介绍转基因的概念及其与基因工程的关系，转基因与非转基因的区分原则，目前常见的转基因类型等。

●1.2其实你对转基因并不陌生

转基因并不是新鲜事，它在自然界早就存在。天然的转基因主要包括两种类型，一是转座子引起的基因转移，几乎每种生物体内都存在。二是两个物种杂交引起的基因转移，包括天然杂交和杂交育种。现代杂交育种技术还会跟现代转基因技术结合。

●1.3转基因技术的诞生和发展

基因工程技术是在什么背景下诞生的？它诞生于哪一年？基因工程技术诞生以后，是怎么发展的？它的发展趋势又是什么？本节介绍了基因工程诞生和发展的简要历程。

●1.4如何制备转基因？

从专业角度来说，将外源的目的基因转移到一个新的受体生物体内，往往需要经过切、接、转、增、检五大环节，才能完成基因工程的整个流程。

第二章转基因操作的“工具箱”

本章主要介绍基因工程操作使用的常用工具酶，包括切断DNA的限制性核酸内切酶，连接不同DNA分子的DNA连接酶，合成并能修饰DNA的大肠杆菌DNA聚合酶I，PCR反应需要的耐高温的Taq DNA聚合酶，以mRNA为模板合成DNA的反转录酶，给DNA分子替换5'磷酸基团的碱性磷酸酶，以及让DNA分子3'末端无限延伸的末端转移酶等。

●2.1限制性核酸内切酶--切割基因的魔术剪

限制性核酸内切酶被称为基因工程操作的手术刀。本节主要介绍了限制性核酸内切酶的发现及作用特点，以及切割DNA分子的不同方式。

●2.2限制性核酸内切酶使用秘笈

本节主要介绍限制性核酸内切酶的三种类型，II型限制性核酸内切酶的主要特点，以及在使用限制性核酸内切酶时要注意的一些地方。

●2.3DNA连接酶--连接基因的缝合针

DNA被切断以后，要用粘合剂把切断的DNA分子连接起来。DNA连接酶就是这样的粘合剂。本节介绍了DNA连接酶的主要类型、连接DNA分子的方式以及对不同末端的DNA分子的连接策略。

●2.4 DNA聚合酶--修饰基因的雕刻刀

DNA分子被限制酶切断以后，是直接就被连接酶缝合起来，还是还要经过其他的修饰再进行连接？DNA聚合酶、碱性磷酸酶和末端转移酶都可以对DNA分子末端进行补平、切平和加上标记，给DNA分子加以不同的修饰。

●2.5DNA聚合酶有多少？

DNA聚合酶是基因工程操作不可或缺的一大类工具酶。它包括大肠杆菌DNA聚合酶I，Klenow大片段酶，T4DNA聚合酶，耐热的Taq酶以及反转录酶。这些DNA聚合酶在基因工程操作的许多方面都会起作用。

●2.6碱性磷酸酶的妙用

碱性磷酸酶能够把DNA或RNA分子5'磷酸基团去掉，那么去掉5'磷酸基团有哪些方面的应用呢？本节主要介绍碱性磷酸酶在防止载体自连方面的作用。

第三章基因转移的“运载车”

本章主要介绍基因工程操作的载体。基因工程载体应该具备什么基本条件？载体有哪些类型？质粒载体、病毒载体和人工染色体各有什么特点以及怎么使用等，是本章的主要知识点。

●3.1转基因需要“运载车”吗？

目的基因不能自己跑到受体细胞中去，而必须依赖基因工程载体。本节介绍了基因工程载体应该具备的基本条件以及基因工程载体的主要类型。

●3.2质粒--轻装上阵的自行车

质粒是使用最多的基因工程载体。质粒作为载体使用应该具备复制子、标记基因和多克隆位点等基本结构。质粒可以作为克隆载体使用，也可以作为表达载体使用。

●3.3病毒--小巧灵活的Smart

病毒能够高效感染细菌和动植物细胞，是使用较多的载体类型。λ噬菌体载体可以携带较大片段的DNA，可以用于构建基因组文库。动物病毒载体能够携带目的基因进入动物细胞和人体细胞，并且整合到基因组上稳定遗传。

●3.4人工染色体--负重前行的大卡车

人类基因组计划的实施对克隆载体的携带能力提出了新要求，现有载体不能满足这个要求，于是构建人工载体的设想提了出来。柯斯质粒和人工染色体是两种人工载体，它们携带外源DNA的能力大大增加，主要用于构建高等生物的大片段基因组文库。

第四章目的基因从哪来？

本章主要介绍获取目的基因的主要途径。从基因组文库获取目的基因是基因工程早期的途径，目前常用的方法是通过PCR扩增基因组DNA以及通过反转录获取真核生物的cDNA基因。如果要改造一个基因或创造一个新基因，则需要实施PCR定点突变的方法。PCR不仅能够获取目的基因，也能够研究基因的表达（荧光定量PCR），进行基因诊断（多重PCR）以及检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位置（反向PCR）。

●4.1基因组文库的构建

基因组文库是把某种生物的基因组DNA切断分装入细菌克隆中保存的方法。本节介绍了基因组文库的构建过程、基因组文库完整性的计算办法以及从基因组文库中筛选目的基因的方法。

●4.2PCR--获取目的基因的快车道

PCR技术是基因克隆的核心技术。PCR技术的诞生有一个美妙的故事。PCR在体外扩增DNA时，引物的设计很关键。PCR技术不仅可以用于获取目的基因，也可用于基因诊断和转基因的鉴定。

●4.3荧光定量PCR--让光检测基因的表达量

荧光定量PCR是目前常用的研究基因实时表达量的方法。荧光定量PCR有荧光染料标记和荧光探针标记两种类型。模板浓度不同，达到荧光阈值所经历的循环数不同，因此可以根据Ct值制作标准曲线，并根据标准曲线计算样本的模板浓度，从而计算基因表达量。

●4.4多重PCR—制作你的基因身份证

多重PCR是一种改进的PCR技术，它同时可以在多个位点进行同一个DNA分子的扩增。多重PCR主要用于基因诊断、DNA指纹、亲子鉴定和基因身份证的制作。

●4.5反向PCR—检测转基因的落脚点

反向PCR是一种巧妙设计的PCR扩增方法，它借助已知序列的末端设计引物扩增两侧的未知序列，从而可以检测转基因在受体细胞染色体上的插入位置以及转座子的插入位置。

●4.6反转录--真核基因的复印机

以DNA为模板合成RNA的过程叫转录，而以RNA为模板合成DNA的过程叫反转录。反转录是获取真核生物基因的主要方法，也是反转录PCR和构建cDNA文库必须使用的方法。

●4.7定点突变--目的基因的改造器

在体外对一个目的基因的特定位点的碱基进行改造，目前只能通过PCR介导的定点突变进行。通过在基因待突变的位点设计引物，分两段扩增目的基因，再把两个PCR产物混合，全长扩增完整的目的基因，就会得到定点突变的目的基因。

第五章转基因的表达

本章主要介绍目的基因在受体细胞内实现高效表达的方法。共介绍了三个高效表达系统：原核生物和真核生物诱导启动子组成的诱导表达系统，T7启动子载体和T7RNA聚合酶组成的大肠杆菌T7表达系统以及目的基因与载体上的担体基因共同组成一个开放阅读框表达的基因融合表达系统。

●5.1基因诱导表达系统

启动子是调控目的基因转录的关键序列。在基因工程操作中，不仅希望启动子功能强大实现基因的高效表达，而且希望启动子是可被诱导表达的，这样目的基因转录的时间和地点就可以被人为控制。本节介绍了原核细胞乳糖启动子诱导系统和真核细胞四环素诱导启动子表达系统。

●5.2基因T7表达系统

目的基因在大肠杆菌细胞中表达时，会借助大肠杆菌RNA聚合酶进行转录。然而使用大肠杆菌RNA聚合酶却有很多缺陷，T7启动子和T7RNA聚合酶可以弥补这些缺陷，实现目的基因高效表达。

●5.3基因融合表达系统

目的基因进入一个新的受体系统中表达会遇到很多不可预期效应。把目的基因与载体上的担体基因融合表达可以实现目的基因稳定表达，并且表达蛋白的可溶性好，还能具有正确的空间结构，并且容易从蛋白混合物中分离出来。

第六章转基因植物

本章主要介绍转基因植物的制备与应用情况。制备转基因植物主要有三种方法，即花粉管通道法，基因枪法和Ti质粒介导法。目前商业化种植的转基因植物主要有两大类性状，即抗除草剂的抗性和抗虫性。本章讨论了抗虫玉米和抗除草剂水稻的抗性机制以及转基因花卉的制备过程。

●6.1转基因植物有多少？

转基因植物被吵得沸沸扬扬，目前世界上到底有多少转基因植物？转基因植物有哪些性状？种植转基因植物的国家有哪些？种植总面积有多少？我国种植转基因的情况如何？本节将用一组可靠的数据来回答你。

●6.2基因如何转入植物细胞？

本节主要介绍三种把外源基因转入植物细胞的方法。花粉管通道法和基因枪法是直接把外源基因导入到植物细胞中，而Ti质粒介导法是利用Ti质粒把外源基因整合到植物细胞的基因组中。

●6.3杂草死了，是转基因植物惹的祸吗？

除草剂杀死杂草的同时，也会把农作物杀死。而抗除草剂的转基因植物具备使除草剂有效成分失活的基因产物，因而除草剂对它不起作用了。但是，杂草不是抗除草剂的转基因植物杀死的。

●6.4抗虫转基因玉米吃不吃得？

抗虫转基因植物是在植物体内转入了抗虫的基因，如Bt毒晶蛋白基因，蛋白酶抑制剂基因或植物凝集素基因。本节介绍了抗虫转基因作物的制备过程以及抗虫的原理，并分析了抗虫转基因玉米对人体会不会造成毒性。

●6.5蓝玫瑰，转基因创造色彩斑斓

转基因技术也能改变花卉的颜色和花卉插花期。蓝玫瑰和蓝菊花就是分别在玫瑰和菊花品种中导入了与蓝色色素合成相关的基因，而白色牵牛花则是在紫色或红色牵牛花品系中抑制了一个花青素基因的表达产生的。

第七章转基因动物

本章主要介绍转基因动物的制备方法与应用前景。制备转基因动物的方法有显微注射法、体细胞克隆法、干细胞法、病毒载体法以及精子载体法等，其中克隆动物和iPS细胞的研究进展很快。转基因动物目前主要用于动物生物反应器制备基因工程药物。

●7.1转基因动物概述（上）

本节介绍了转基因动物的概念与发展历史以及用显微注射法和体细胞克隆法制备转基因动物的过程，并分析了两种方法各自的优缺点。

●7.2转基因动物概述（下）

本节介绍了另外三种制备转基因动物的方法，分别是干细胞法、病毒载体法和精子载体法，并分析了三种方法各自的优缺点。

●7.3从克隆羊到克隆猴

克隆是大家耳熟能详的一个名词。本节介绍了克隆动物的发展历程以及克隆动物的意义，并分析了克隆技术给人类自身带来的影响。

●7.4iPS细胞诞生记

iPS细胞是一种人工诱导的多能干细胞，它诞生于2007年。iPS细胞一经诞生，就展现了巨大的应用价值，不仅可以用iPS细胞在体外培育组织器官，甚至可以在体内发育成完整的个体，例如我国科学家就证明了iPS细胞的全能性。

●7.5动物生物反应器

本节介绍了动物生物反应器的概念和主要类型，其中目前应用较多的是乳腺生物反应器，已经利用乳腺生物反应器生产了多种药物。而其他类型的生物反应器则有种种局限，还未得到大规模的应用。

第八章转基因的检测

本章主要介绍目的基因被转入受体细胞之后如何检测和鉴定。常用的方法包括根据载体上的标记基因进行遗传表型检测，通过酶切电泳的方法检测空载体和阳性转化子的克隆，通过DNA印迹的方法检测目的基因是否进入受体细胞并整合到受体细胞基因组上，通过RNA印迹的方法检测目的基因是否能转录产生mRNA,并进一步通过蛋白质印迹的方法检测目的基因是否能在受体细胞内表达产生蛋白质。最后，为了确定转入的外源基因的确是目的基因本身，还必须要对转入的基因进行DNA序列测定。

●8.1打开基因标记的指示灯

根据载体的标记基因进行阳性克隆的筛选是转基因鉴定的第一步。本节介绍了三种类型的标记基因：抗生素抗性标记基因，乳糖操纵子的lacZ标记基因以及绿色荧光蛋白标记基因。

●8.2酶切电泳检测阳性转化子

酶切电泳检测阳性转化子是检测阳性克隆最经济、最便捷、最快速的方法。本节介绍了酶切电泳检测阳性转化子的四种类型：直接凝胶电泳检测、单酶切检测、双酶切检测和根据目的基因内部的酶切位点进行酶切检测等。

●8.3Southern blot--灰姑娘与水晶鞋

Southern印迹是根据探针杂交检测目的DNA是否进入受体细胞的方法。Southern印迹是如何诞生的？它的原理和操作流程是什么？怎么判断Southern结果？为什么说它像王子寻找灰姑娘的故事呢？

●8.4Northern blot--容易受伤的灰姑娘

Northern印迹是检测目的基因是否已经在受体细胞内转录产生mRNA的经典方法。Northern名称是怎么来的？Northern杂交的流程与Southern杂交有什么异同？它的结果又有什么特殊性？为什么说它是容易受伤的灰姑娘？

●8.5Western blot--寻觅灰姑娘的小王子

Western印迹是检测目的基因是否已经在受体细胞内表达产生蛋白质的常用方法。Western印迹的原理与Southern杂交有什么不同？它的流程与Southern杂交有相似性吗？如何检测和解读Western的结果？

●8.6读懂DNA序列密码

要判断转入受体细胞内的基因就是目的基因本身，最令人信服的证据就是直接对基因进行序列测定。传统的DNA测序主要有末端终止法测序和化学降解法测序两种方法，后来广泛使用的DNA自动测序则是在末端终止法的基础上发展起来的。

●8.7开启基因检测快车道

DNA测序是近年生物技术领域发展速度最快的前沿技术之一，已经从一代测序发展到二代测序，如今更是步入三代单分子测序时代。本节介绍了高通量测序的主要类型以及焦磷酸测序和Solexa测序的基本原理。

●8.8高通量测序走四方

高通量测序发展速度那么快，它已经在组学研究中发挥了重要的作用。组学测序包括基因组测序即Southern测序，RNA组测序即Northern测序，与特定蛋白质结合的全部DNA序列的测序即Western测序以及DNA甲基化组测序即Eastern测序等四大类型。

第九章基因的转出

本章主要介绍基因敲除与基因沉默技术，也就是让基因功能失活的基因“转出”策略。传统的基因敲除技术主要是利用小鼠和大鼠的ES细胞进行同源重组来完成基因的功能失活的，包括完全基因敲除和条件基因敲除技术。自从RNA干扰现象发现之后，极大地加快了基因功能失活技术研究的速度。近几年，TALEN基因打靶和CRISPR基因打靶技术迅猛发展，为基因敲除和基因组编辑提供了强有力的手段。

●9.1完全基因敲除--从“大力水手”的故事说开去

Myostain，肌肉生长抑制素的基因突变，可以使一个四岁男孩变得像大力水手一样力大无穷。怎么能够在体内让一个特定的基因突变或功能失活呢？基因敲除可以实现这一点。本节介绍了传统基因敲除的思路及构建敲除个体的流程，以及基因敲除在基因功能研究中的意义和局限性。

●9.2条件基因敲除--我爱吃菠菜，所以我身强体又壮完全基因敲除--从“大力水手”的故事说开去

某些重要的功能基因被敲除后，可能导致个体无法存活。有没有办法让基因只在特定的时间和地点失活，就像大力水手只是在吃了菠菜之后才会变成超人？条件基因敲除可以做到。本节主要介绍条件基因敲除构建的思路和条件设置以及实现特定时间和空间打靶的原理。

●9.3TALEN打靶--如来神掌

正当其他动物因为缺乏可用的ES细胞而苦于无法享受基因敲除的美妙时，一种奇妙的可用于任何细胞的基因打靶技术横空出世了--TALEN打靶，它就像如来神掌，给细胞中的DNA重重一击，DNA便会一刀两断，失去功能。本节主要介绍TALEN打靶技术的思路来源和构建原理及其应用。

●9.4CRISPR打靶--上古神器

TALEN打靶技术刚刚建立一年，另一种更奇妙更简便的基因打靶技术就呼啸而出。CRISPR打靶，只要一条向导RNA就可以指向哪里，哪里的DNA就会断裂，这种极简的打靶技术早在上古时代就已存在。本节介绍了CRISPR现象的发现历程以及CRISPR打靶技术的设计原理,CRISPR技术的拓展和应用。

●9.5RNA干扰--小李飞刀

早在TALEN打靶和CRISPR打靶技术建立之前，有一种轻便却威力无穷的基因沉默技术就称霸功能基因组学研究领域十来年，迄今仍然被广泛使用，它就是RNA干扰技术。向细胞内注射一段双链RNA，内源同源基因的mRNA就降解了。RNA干扰技术是怎么发现的？它的作用机制是什么？它的应用现状又是怎样的？这是本节希望回答的问题。

第十章基因治疗

本章主要介绍基因治疗的策略与发展历史。基因治疗于1990年首获成功，但是基因治疗的发展却经历了十分缓慢的历程，沉寂了将近20年，才终于重新走上快速发展之路。治疗基因导入人体细胞开展基因治疗主要依赖于病毒载体，包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺相关病毒载体。目前开展的基因治疗主要针对肿瘤、艾滋病和单基因遗传病，尤其是肿瘤的基因治疗进展较快，CAR-T治疗和针对抑癌基因的治疗都取得了可喜的成效。

●10.1基因治疗概述

脊髓性肌萎缩症是一种常染色体隐性遗传病，是一种不治之症，然而患病女孩Evelyn却被治好了！她是如何被治疗的？本节介绍了基因治疗的概念和基因治疗的主要策略及治疗途径。

●10.2基因治疗的发展历史（上）

本节回顾了基因治疗的诞生历程以及1990年第一例成功的基因治疗的案例。德希尔瓦成为第一个基因治疗治愈的病人，但是基因治疗的发展道路并不顺利。

●10.3基因治疗的发展历史（下）

第一例成功的基因治疗诞生以后，人们对基因治疗寄予厚望。然而它却没有像人们期望的那样迅速发展，而是走向了低谷。本节回顾了两个基因治疗失败的案例以及它带给人们的反思。

●10.4基因治疗的载体(上）

治疗基因要想进入人体细胞，也必须依赖基因治疗的载体。基因治疗载体有哪些类型呢？本节主要介绍了腺病毒载体和逆转录病毒载体作为基因治疗载体的优缺点。

●10.5基因治疗的载体（下）

既然腺病毒载体和逆转录病毒载体都不完美，那么什么才是完美的基因治疗载体呢？本节介绍了慢病毒和腺相关病毒两种基因治疗载体，并分析它们的优缺点和应用前景。

●10.6肿瘤的基因治疗

肿瘤是一类发病率和死亡率都很高的恶性疾病，大部分肿瘤还找不到根治的方法，人们寄希望于基因治疗。本节介绍了对肿瘤采取基因治疗的主要策略，以及这些治疗策略的应用进展。

●10.7艾滋病的基因治疗

艾滋病是对人体生命和健康危害严重的一类感染性疾病，发病率也很高。目前的治疗方法只能延缓艾滋病情的发展，却不能彻底去除艾滋病毒。然而世界上却有唯一的一例治愈的艾滋病人，他被称为柏林病人。本节介绍了柏林病人的故事以及柏林病人给艾滋病开展基因治疗提供的线索和思路。

●10.8CAR-T免疫治疗--滚蛋吧，肿瘤君！

在肿瘤基因治疗领域，CAR-T免疫治疗这两年发展很快。CAR-T是指嵌合抗原受体T细胞。它是如何组装的？它的发展历程是怎样的？目前CAR-T免疫治疗的现状和应用前景怎样？本节将为你介绍。

第十一章转基因技术的应用

本章主要介绍基因工程技术在工农业生产和医药领域的应用。基因工程在能源工业、环保工业和食品工业的应用已经深入并具有广阔的前景。转基因农作物已经大面积种植并已经获得巨大的经济收益。基因工程制药已经替代传统制药，占领了极大的市场份额。而功能基因组学研究几乎离不开基因工程技术的各种手段。在功能基因组学研究中，DNA与蛋白质以及蛋白质之间的相互作用是重要的研究内容，凝胶迁移率阻滞、染色质免疫沉淀、酵母双杂交和免疫共沉淀是研究基因相互作用的主要方法。

●11.1基因工程在工业领域的应用

基因工程跨越物种隔离的屏障，随意组合跨界生物的基因组，为创造新物种和新工具提供了无限种可能性。许多传统方法克服不了的屏障，都有可能通过基因工程手段克服。例如重金属污染、白色垃圾和农药残留等环境问题，可望通过基因工程菌解决。能源危机，也可以通过基因工程改造获取生物能源。食品工业生产的氨基酸、有机酸和凝乳酶，则早已通过基因工程菌得到普及空军建‘’好4ISR哈他

●11.2基因工程在农业领域的应用

基因工程的初衷就是通过转基因的方法改良动植物品种，提高动植物产量和品质。目前，转基因农作物已经涉及主要粮食作物和农作物品种，惠及了很多国家和农户。转基因性状涉及抗虫性、除草剂抗性和其他抗逆性，以及品质改良的某些性状，如增加维生素含量等。转基因动物的性状改良主要涉及提高生长率和抗病性，目前仅有一个转基因动物品种获得商业化上市许可。

●11.3基因工程在医药领域的应用

基因工程最早的应用就是在基因工程制药行业，通过微生物、酵母和动物生物反应器已经生产了大量人类小分子多肽药物和抗体及疫苗，基因工程制药也获得了巨额的商业利润。此外，基因工程技术在基因诊断、基因治疗、异种器官移植和建立人类重大疾病的动物模型等方面的应用也取得了巨大的成效。

●11.4基因工程在功能基因组学研究中的应用

人类基因组计划完成后，生命科学已经进入功能基因组学时代，就是诠释和揭示人类基因的功能及其与发育和疾病的关系。研究基因的功能包括研究基因的表达谱、基因功能失活研究、基因过表达和基因的相互作用研究等多个方面，而所有这些研究技术都涉及基因工程技术，因此基因工程在功能基因组学研究中具有重要作用。

●11.5凝胶迁移率阻滞

凝胶迁移率阻滞是在体外研究DNA与蛋白质结合的常用方法。本节主要介绍了凝胶迁移率阻滞实验的原理和实验设计方案以及主要应用。

●11.6染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀是研究体内蛋白质与DNA结合的技术。本节主要介绍染色质免疫沉淀的概念，CHIP操作流程，CHIP-on-chip和CHIP-Seq的原理以及它们的应用。

●11.7酵母双杂交

酵母双杂交是研究细胞内两个蛋白质是否相互作用的方法。本节主要介绍酵母双杂交的原理，酵母双杂交的应用和酵母双杂交的优缺点。

●11.8免疫共沉淀

免疫共沉淀也是研究细胞内两个蛋白质是否结合的方法。本节介绍了免疫共沉淀的原理，COIP的操作流程，COIP的应用以及如何构建标签融合蛋白进行COIP的研究等。

第十二章转基因的监管

本章主要介绍转基因生物的安全性及其安全评价内容和监管原则。转基因生物的安全性是生物安全的重要内容，也是各级政府和广大民众关注的焦点。本章内容包括转基因生物安全性的主要内容，转基因安全评价的原则和主要内容，以及国际组织和我国建立的转基因安全性的法律法规等监管条例等。

●12.1转基因的安全性

转基因生物的安全性是生物安全的重要内容。转基因生物安全性又包括转基因操作安全性和转基因产品安全性，例如转基因产品对人体健康和生态环境的影响等。本节就转基因生物安全性的内容和现状进行了讨论。

●12.2转基因安全评价程序

转基因生物是否安全依赖生物安全评价。本节介绍了国际上一致认可的转基因生物安全评价的原则和标准，以及转基因生物安全评价的主要内容和我国发放的转基因生物安全证书情况等。

●12.3转基因安全的监管

本节主要介绍转基因生物安全监管条例产生的历史背景和国际组织关于转基因安全监管的各种法规以及我国对转基因生物安全监管的法规法律文件及监管机构。